Reactivos

En esta sección se presentan en forma resumida los contenidos de los principales reactivos utilizados en el laboratorio de Biología Molecular.

Recuerde las siguientes conversiones métricas:
1 mililitro = 0.001 litros
1 microlitro= 0.001 mililitros = 0.000001 litros
1 M = Peso Molecular (FW) expresado en gramos para 1 litro.
En la preparación de todos los reactivos se recomienda agua destilada, desionizada y esterilizada.

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Azul de bromofenol.

  • 7 M Urea
  • 10 mM EDTA
  • 5 gr Sacarosa
  • 10 mg Azul de bromofenol
  • Aforar a 10 ml.

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Bromuro de etidio

  • 50 ml Bromuro de etidium (10 mg/ ml)
  • 50 ml Agua

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Cajas petri con medio LB con ampicilina


 (concentración final 100 m g/ml), X-Gal e IPTG.
Preparar LB agar para 20 cajas (aproximadamente 500 ml).
Esterilizar en autoclave y enfriar a 50ºC.
Agregar 500 m l de ampicilina (100 mg/ml)
1 ml de X-Gal
1 ml de IPTG
Dividir en las cajas (aprox. 20 ml por caja).
Preparación de X-Gal (20 mg/ml).
X-Gal 100 mg.
Dimetilprmamida 4 ml
Disolver y completar a 5 ml de volúmen final.
Separar en alícuotas de 1 ml y conservarla a -20ºC.
Preparación de IPTG (200 mg/ml).
IPTG 1 g
Agua· dd 4 ml
Disolver y completar a 5 ml de volúmen final.
Separar en alícuotas de 1 ml y conservar a -20ºC.
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Cloroformo-Alcohol isoamílico

 

  • 24 partes Cloroformo
  • 1 parte Alcohol isoamílico

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Fenol estabilizado

Es importante insistir en que el fenol puede provocar diversos daños, por lo que es importante prepararlo en campana, protegiéndose con bata y guantes.
Protocolo para preparar 50 ml, se puede almacenar a 4ºC hasta por un mes.

  • Remueva el fenol liquificado del congelador, caliente a temperatura del cuarto y funda a 68ºC
  • Agregue 50 ml de fenol fundido en un frasco.
  • Agregue Hidroxiquinolina a una concentración final del 0.1 %, para colorear la fase fenólica).
  • Agregue 50 ml de Tris (0.5 M pH 8.0) y agite 15 minutos, con barra magnética.
  • Permita que se separen las fases, aspirando toda la fase acuosa posible.
  • Agregue 50 ml de 0.1 M tris (0.1 M, pH 8.0) y agite 15 minutos.
  • Remueva la fase acuosa.
  • Repita la extracción con 50 ml de tris (0.1 M, pH 8.0), hasta que el pH de la fase fenólica sea de 7.8 o mayor.
  • Se agrega 0.1 volúmenes de tris-HCl 0.1 M, pH 8.0 con 0.2% de Beta-mercaptoetanol.

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Fenol-Cloroformo-Alcohol isoamílico

  • 25 partes Fenol equilibrado
  • 24 partes Cloroformo
  • 1 parte Alcohol isoamílico

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Proteinasa K


 
100 mg Proteinasa K

5 ml Agua

Guardar en alícuotas a -20 C

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SDS al 20 %


100 gr SDS
375 ml Agua.dd
Ajustar el pH a 7.2 con HCl y aforar a 500 ml.
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TAE (solución 50X), pH 8.5


2 M Tris
1M Acido acético
0.5 M EDTA. Na2

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TBE 5X (Solución para almacenamiento)


La concentración de uso es de 0.5 X

  • 54 g Tris base (FW= 121.14)
  • 27.5 g äcido Bórico (FW= 61.83)
  • 20 mL  EDTA 0.5 M (pH 8.0)
  • AFORAR A 1 Lt
    • Para preparar EDTA 0.5 M, para 500 mL
    • Agregue 93.05 g EDTA disodico (FW= 372.2), en aproximadamente 400 mL Agua.dde, ajuste el pH a 8.0 con NaOH y disuelva.
    • NOTA IMPORTANTE: para que se disuelva el EDTA primero se debe ajustar el pH, de otra forma no se disolverá.
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TE-RNasa (10 ml)


1 ml Acetato de Sodio 1M, pH 4.8
0.6 ml EDTA 50 mM, pH 4.8
100 mg RNasa A
Se divide en alicuotas de 200 m l en tubos con tapadera.
Los tubos se colocan en baño de agua hirviente durante 10 minutos.
Se conserva a -20ºC.
Para la RNasa de uso se agrega TE 0.1X, para obtener una concentración final de 200 m g/ ml. Por ejemplo a 10 m l de RNasa se le agregan 490 m l de TE 0.1X.
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TEK, pH 7.5

 

  • 50 mM tris
  • 10 mM EDTA
  • 1.5% KCl
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TEK-Igepal


9 ml TEK
1 ml Igepal
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TE, pH 8.0


10 mM Tris
1 mM EDTA
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SOC


Bacteriopeptona 2 g
Extracto de levadura 0.55 g
NaCl 1 M 1 ml
KCl 1 M 1ml
Agua· dd 97 ml
Agitar hasta su dilución. Autoclavar. Enfriar a 55ºC y agregar 1 ml de Mg++ 2M (MgCl2 1 M, MgSO4 1M) y 1 ml de glucosa 2 M.
Filtrar el medio completo en filtro de membrana 0.2 m .
Preparar los filtros pasando 100 ml de agua· dd, antes de filtrar al vacio.
pH Final aproximadamente 7.0
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STE (solución de lisis para extracción de ADN)

 

  • 10mM Tris base- HCl pH 8.0
  • 400 mM NaCl;  (diversos autores sugieren entre 100 y 400 mM, dependiendo del organismo de donde se pretende extraer ADN)
  • 2 mM EDTA disodico (Recordar que es un agente castrante del magnesio requerido por las nucleasas, por lo que de ser necesario se puede llevar hasta 200 mM, aunque posteriormente se debe prestar especial cuidado para eliminar el exceso de EDTA, generalmente es requerido entre 1 y 5 mM)
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Solución de lisis (bacterias)


Para10 ml, se requieren:

  • 2 ml de NaOH 1N,
  • 1ml SDS 10% y
  • 7 ml H2O· dd).

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adn