PRÁCTICA 4: Tinción Gram
INTRODUCCION:
En la sesión se busca promover el uso de técnicas de tinción para la exploración y caracterización de las paredes celulares, en este caso de procariontes, con la técnica de tinción Gram. Para el reporte de práctica se recomienda investigar el marco de referencia teórico de la sesión.
Competencia: Diferenciar las estrategias para el estudio de las cubiertas celulares, mediante el análisis de las técnicas básicas, para su utilización en laboratorio, con actitud crítica.
MATERIAL:
Pipeteador
Pinzas
Palillos
Portaobjetos y cubreobjetos
¿Qué debe llevar al laboratorio?
Muestras en las que evidentemente existan bacterias, como por ejemplo yogurt, muestra de pus, nódulos de gramíneas, esputo.
Microscopio compuesto para iluminación Köheler y papel para limpiar microscopio
Metodología:
Tinción Gram
l. Coloque la muestra sobre el portaobjetos y distribúyala realizando un frotis.
Frotis
2. Fije la muestra por secado, pasándolo sobre un mechero. El paso del portaobjetos sobre la llama del mechero debe ser rápido, repita hasta que este seca la muestra. La temperatura del porta debe ser la que soporta el dorso de la mano sin quemarla
3. Coloque unas gotas del colorante violeta de genciana, cubriendo la extensión; el tiempo de actuación del colorante es de dos minutos.
4. Lave con agua destilada para arrastrar el colorante.
5. Ponga solución de lugol durante un minuto.
6. Lave nuevamente con agua destilada.
7. Decolore con unas gotas de alcohol de 96°, que debe actuar de 30 segundos a un minuto, para arrastrar el colorante que queda libre.
8. Lave cuidadosamente con agua destilada.
9. Agregue unas gotas de safranina durante un minuto.
10. Lave con agua destilada.
11. Seque al aire.
12. Agregue aceite de inmersión y observe a 100X, utilizando adecuadamente el aceite mineral.
13. Utilizando la iluminación Kölher y optimizando la iluminación, observe las células. No se olvide utilizar ampliamente el sistema de iluminación, así como los campos de poca y gran profundidad, así como el uso del micrómetro para el adecuado enfoque por cada campo.
14. Esquematice sus observaciones.
Las bacterias Gram positivas aparecen en visión microscópica teñidas de un color morado intenso, por la violeta de genciana.
Las bacterias Gram negativas, aparecen en visión microscópica teñidas de un color rosado débil, por la safranina.
Obtención de muestras de bacterias
a) Se arranca del suelo una planta de leguminosa con sus raíces. En las raicillas finas se verán unos nódulos en forma de pequeñas verrugas. Con las pinzas se desprende un nódulo. Se lava para quitarle la arena. El nódulo se parte con el bisturí sobre un portaobjetos agregando una gota de agua. Se quitan los residuos del nódulo, secando la preparación a la llama del mechero, se coloca el portaobjetos en el soporte de tinciones y se tiñe según la técnica de Gram.
b) Con la aguja de disección se toma una pequeña porción de yogurt. Se disuelve en una gota de agua y se hace una extensión sobre el portaobjetos. Se lava la preparación, dejando caer con un cuentagotas unas gotas de la mezcla alcohol-cloroformo para arrastrar las gotas de grasa del yogurt y se deja secar al aire. El portaobjetos se coloca en el soporte de tinciones y se tiñe según la técnica de Gram.
c) Disuelva en una gota de agua sobre un portaobjetos, una pequeña porción de sarro dentario tomada con la aguja y con esto se hace una extensión o frotis que se seca a la llama del mechero. Se coloca el portaobjetos en el soporte de tinciones y se tiñe según la técnica de Gram.
Rhizobium leguminosarum: Nódulos de leguminosas: trébol, soya, alfalfa. Gram negativas
Acetobacter aceti: Telita que se forma sobre el vinagre. Gram negativa.
Lactobacilus vulgaris: Yogurt. Gram positiva
Informe de resultados
Los resultados de una tinción de Gram se reportan como sigue:
- Forma bacteriana
- Coloración
- Agrupación bacteriana (escasa, media, abundante)
- En muestras de esputo, excretas, saliva o "pus" se considera la respuesta leucocitaria y su tipo (polimorfonuclear o monocitos) así como el conteo de células epiteliales a 10X.
La flora bacteriana observada por tinción de Gram se informa por género, forma o agrupación, pero nunca por especie, ya que la identificación solo se puede lograr mediante pruebas bioquímicas
