PRÁCTICA 7: Mitocondrias
INTRODUCCION:
En la sesión se busca promover el desarrollo de habilidades para la separación de mitocondrias y su observación. Para el reporte de práctica se recomienda investigar el marco de referencia teórico de la sesión.
Competencia: Comparar los métodos utilizados para la identificación de orgánelos en tejidos multicelulares, con base en la utilización de técnicas básicas, para su posterior aplicación en el campo profesional, con disciplina y respeto.
Materiales y equipos
Tubos eppendorf
Tubos de centrífuga
Homogeneizador
Amortiguador STE y TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%)
Sacarosa
Centrífuga eppendorf
Centrífuga refrigerada
Mini fuga
¿Qué debe llevar al laboratorio?
Al menos 1 gramo de tejido animal fresco, rico en mitocondrias
Por cada 4 estudiantes 1 microscopio compuesto y papel para limpiar microscopio
Metodología:
Extracción de mitocondrias
Extracción de mitocondrias a partir de tejidos ricos en mitocondrias, utilizando al menos de 3 a 5 gr. de tejido rico en mitocondrias, preferentemente de hígado, cerebro o gónadas maduras.
1. Con un homogeneizador de aspas o vidrio, se homogeneiza el tejido (3 a 5 gr., rico en mitocondrias) en dos volúmenes de TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%). Durante el homogeneizado mantenga la muestra en hielo y evite la formación de espuma (característica de un exceso de molido y la liberación de un exceso de enzimas).
2. Centrifugue a 200 xg, por 5 min. a 4 C. Descarte el precipitado.
3. Subyaciendo (es decir desde la parte de abajo), agregue lentamente un volumen de TEK-15% sacarosa.
4. Centrifugue (1,500 xg por 10 min. a 4ºC) y obtenga el precipitado (obscuro- núcleos) y el sobrenadante (claro- mitocondrias), en la interface entre el TEK y el TEK-sacarosa se concentran las mitocondrias.
5. Para concentrar el precipitado del sobrenadante claro, agregue al menos uno o dos volúmenes de TEK, centrifugue a 14,000 x g durante 15 minutos a 4 º C y del producto de la centrifugación elimine el sobrenadante por decantación.
Nota: Tome en cuenta que, para concentrar las fases obtenidas en el paso cuatro, se debe diluir TEK-sacarosa arrastrado en la separación, con al menos dos volúmenes de TEK, esto para cambiar la densidad de la solución y se puedan precipitar fácilmente las mitocondrias o los núcleos con la centrifugación.
6. Puede realizar las observaciones o resuspenda el precipitado con TEK (mitocondrias en 0.9 ml por cada 5 gr. de tejido inicial), para conservar en el ultracongelador, correctamente etiquetado.
7. Para observar los orgánelos, coloque la muestra en un portaobjetos, agregue una gota de colorante y cubra con el cubreobjetos. Para las mitocondrias tiña con verde de malaquita. Recuerde que el tamaño máximo de las mitocondrias oscila en los 7 micrómetros y las pequeñas hasta el micrómetro.
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Protocolo alternativo
En forma alternativa, con el uso de la centrifuga en pasos rápidos se puede obtener mitocondrias, aunque con menor calidad.
1. Con un homogeneizador de aspas o vidrio, se homogeneiza el tejido (3 a 5 gr., rico en mitocondrias) en dos volúmenes de TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%). Durante el homogeneizado mantenga la muestra en hielo y evite la formación de espuma (característica de un exceso de molido).
2. Centrifugue a 200 xg, por 5 min. a 4⁰C. Descarte el precipitado que contiene basura.
3. Centrifugue (1,500 xg por 10 min. a 4⁰C).
4. Con cuidado por decantación retire el sobrenadante a un tubo limpio, recordando que en esta fase se encuentran las mitocondrias. En el precipitado obscuro que queda en el tubo se encuentran los núcleos.
5. El sobrenadante se centrifuga a 14,000 xg por 15 minutos a 4 C.6. Puede realizar las observaciones utilizando una tinción simple con verde de malaquita. Coloque la muestra en un portaobjetos, agregue una gota de colorante y coloque el cubreobjetos.
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Recomendaciones para plasmar los resultados y su análisis
Describa en cada protocolo lo que sucede en cada paso.
Analice cada uno de los pasos, con base en la información teórica de la práctica, es decir interprete lo que se hace en cada paso.
Con base en el análisis, describa puntualmente lo que aprendió.
