Cuantificación de ADN
Para la cuantificación del ADN, existen dos métodos indirectos que permiten estimar la concentración del ADN en las muestras, por visualización y mediante espectrofotómetro.
Estimación de la concentración de ADN por visualización.
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El método indirecto más recomendable para la determinación de la concentración de ADN en una muestra es mediante la visualización de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas. El procedimiento requiere la preparación de una cámara de electroforesis, colocando cada una de las muestras que se desea evaluar en pozos individuales y dejando al menos 10 pozos libres. Posteriormente se inicia la electroforesis con 6 v/cm y diez minutos antes de que concluya la corrida, se detiene la fuente de poder, se destapa la cámara de electroforesis, sembrando muestras de concentraciones conocidas. Finalmente se cierra la cámara de electroforesis, se enciende nuevamente la fuente de poder, dejando que corra durante 10 minutos, se visualiza el producto con U.V. y se toma una fotografía. En este método la estimación se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algún programa computacional que contraste intensidades de color. |
Estimación mediante espectofotómetro.
En este método se utiliza un espectofotómetro que mida la absorbancia a 260 nm y 280 nm. En un equipo automatizado se sigue el siguiente protocolo.
- Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas.
Preparación del blanco.
- Agregue 10 m l de TE-RNasa (o la solución que utilizó para resuspender el ADN de la muestra problema) y 990 m l de Agua .dd, en una celda, asegurandose de la perfecta homogeneización.
- Coloque la celda en la posición 1 del espectrofotómetro.
Preparación de las muestras.
- Agregue 10 m l de la muestra problema y 990 m l de Agua .dd, en otra celda, asegurándose de la perfecta homogeneización.
Lectura.
Para la lectura solo se tiene que responder con el teclado del equipo las preguntas que aparecen en pantalla. El equipo permite evaluar la concentración de proteínas (limpieza de la muestra), presencia de ARN y concentración de oligos (ADN degradado).
Es importante aclarar que la relación A260/A280nm no es lineal, por lo que puede llevar a lecturas erróneas, recomendándose solo como método complementario de evaluación.
