ADN

Existe una amplia diversidad de técnicas para el estudio del ADN, entre las que para fines del curso se destacan las utilizadas convencionalmente para la extracción de ADN a partir de organelos o la extracción total.

Fenolica DNAzol Cloroformo CTAB Extracción de ADN mitocondrial
Extracción casera Extracción Salina     Explicación general

Extracción de ADN total (extracción fenólica)

  1. - Se cortan muy finamente 40 a 200 mg de tejido, evitando las escamas y huesos.
  2. - La muestra se homogeneiza utilizando uno de los métodos mecánicos.
  3. - En un tubo con tapa se agregan 400 µl del amortiguador STE (Tris-HCL M pH; EDTA M y NaCl M), 40 ml de SDS al 20% y 40 ml de proteinasa K.
  4. - Se deja en agitación suave por 1 hora (Proteinasa K de la compañia sigma), a temperatura ambiente.

- Continúe con la extracción fenólica que se indica adelante.

Extracción fenólica.

  1. - Agregar 400 µl de fenol estabilizado, agitándose hasta la formación de la emulsión.
  2. - Centrifugar a 12,000 x g por 10 minutos a termperatura ambiente (TA). Se recoge la fase acuosa.
  3. - Agregar 400m l de Cloroformo- Alcohol isoamílico (24: 1; v:v), agitándose suavemente.
  4. - Centrifugar a 12,000 x g por 10 minutos. Se recoge el sobrenadante.
  5. - Agregar 1/8 del volumen de acetato de sodio 3 o 4M.
  6. - Agregar 2 volúmenes de Isopropanol (1 ml).
  7. - Dejar en reposo 15 min a TA.
  8. - Centrifugar a 12,000 x g por 10 minutos. Se tira el líquido suavemente, sin perturbar el precipitado.
  9. - Agregar 400m l de Isopropanol 70%, sin agitar.
  10. - Centrifugar a 12,000 x g por 10 minutos. Se elimina el líquido suavemente, sin perturbar el precipitado.
  11. - Secar el precipitado a 37ºC, de 30 minutos a 1 hora, o 8 horas a temperatura ambiente.
  12. - Agregar 200m l de TE.
  13. - Conservar a -20ºC, hasta su posterior uso.

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Extracción con DNAZOL

  1. Homogenice 0.1 g de tejido, preferentemente con nitrógeno líquido, utilizando un mortero al que se le agrega el tejido y nitrógeno, aplique con 3 o 4 golpes del pistilo y repita hasta tener un fino polvo, el cual se transfiere a un tubo al que se le agregan 0.3 mL de la solución. Un método alternativo es con un homogenizador de vidrio, al que se le agrega el tejido y gradualmente los 0.3 mL de la solución; la mezcla obtenida se pasa a un tubo.
  2. Agite el tubo a 25 ºC, durante 5 minuto, posteriormente agregue 0.3 mL de cloroformo, mezcle vigorosamente e incube 5 minutos a 25 ºC.
  3. Centrifugue a 12,000 x g, por 10 minutos a TA (temperatura ambiente).
  4. Con cuidado, transfiera la fase acuosa (sobrenadante) a una tubo limpio.
  5. De ser necesario repita el paso del cloroformo.
  6. Agregue al sobrenadante 0.225 mL de etanol absoluto y mezcle, invirtiendo el tubo 6 a 8 veces. Guarde a TA por 5 minutos.
  7. Centrifugue a 5,000 x g, por 4 minutos y remueva el sobrenadante (nota el pellet contiene al ADN).
  8. En caso de requerirse un lavado adicional, agregue al pellet, 0.3 Ml de la solución, con 0.225 mL de etanol absoluto y mezcle vigorosamente. Guarde a TA por 5 minutos.
  9. Centrifugue a 5,000 x g, por 4 minutos y remueva el sobrenadante.
  10. Agregue al pellet, 0.3 Ml de etanol al 75% y mezcle vigorosamente.
  11. Centrifugue a 5,000 x g, por 4 minutos y remueva el sobrenadante.
  12. Remueva al alcohol, seque el pellet y resuspenda en 0.07 mL de solución TE.

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Extracción de cloroformo

  1. Homogenizar el tejido (40 a 200 mg) con 613µL de solución de lisis ( 10mM Tris; 400 mM NaCl; 2 mM Na2*EDTA) 30µL SDS (al 20% en TEN -solución de lisis-) y 7 µl de proteinasa K (20 µg /ml). La mezcla se homogeniza y se mantiene en agitación constante de 5 a 24 horas.
    1. Nota: es importante verificar la adecuada agitación durante la primer hora, regla empírica, recuerde que con bajo tiempo de digestión hay poca separación de ADN, contrastantemente un tiempo prolongado puede incrementar la degradación de los ácidos nucleícos, y en consecuencia también hay poca obtención de ADN. Un tiempo generalmente adecuado es de 12 a 14 horas (overnight).
  2. Al tubo se le agregan 375 µl de NaCl 6M (previamente filtrado). Para lograr una adecuada homogenización puede utilizar el Vortex durante 10 segundos, y se centrifuga en TA (temperatura ambiente) por 15 min. a 14,000 xg.
  3. Pasar a un tubo limpio los 780 µl de la fase superior, se le agregan 750 µl de Cloroformo, y depues de homogeneizar completamente (con vortex 10 segundos), se centrifuga a 10,000 rpm por 10 min.
  4. Posteriormente se toman aproximadamente 750 µl del sobrenadante, evitando tomar o tocar la interfase que contiene residuos de proteínas y de otras moléculas orgánicas. Considere que es preferible tomar menos líquido, pero no contaminado.
  5. Al sobrenadante se le agregan 750 µl de Isopropanol, se homogeniza. Es recomendable dejar reposar el tubo en posición vertical, durante unos 30 min a TA o en refrigerador, para facilitar la precipitación del ADN.
  6. Las muestras son centrifugadas a 10,000 rpm por 15 min, TA.
  7. El sobrenadante es retirado cuidadosamente, procurando no perturbar el fondo del tubo, en donde esta depositado el ADN.
  8. Para secar el pellet, se deja el tubo abierto a 37 C, durante media hora o se coloca en un sistema de vacío.
  9. Finalmente el pellet seco, se resuspende con 100 µl de TE.
    Para conservar la muestra se guarda en congelación a –20?C (durante meses) o a –80?C (durante años).

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Extracción de ADN con CTAB

  1. Aproximadamente de 10 a 40 mg de tejido se colocan en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
  2. Al tubo se le agregan 200 µl de solución de lisis (200 mM Tris Base, pH 7.4; 0.5 % SDS; 250 mM Na Cl y 25 mM EDTA*Na2 ). La mezcla se homogeniza y se mantiene en agitación constante durante 20 minutos. Nota: es importante verificar la adecuada agitación.
  3. A la muestra agregarle 200 µl de solución CTAB( CTAB 2%, PVP 0.1 %, SDS 0.1%, 0.2 ß- mercanoetanol, 100 mM TRIS base 10 mM y 20 mM EDTA*Na2), y se mantiene a 65 C.
  4. Se agregan 300 µl de LiCl 5M, logrando una adecuada homogenización y se centrifuga en TA (temperatura ambiente) por 15 min. a 14,000 xg.
  5. A un tubo limpio con 780 µl del sobrenadante, se le agregan 750 µl de Cloroformo, y depues de homogeneizar completamente (con vortex 10 segundos), se centrifuga a 10,000 rpm por 10 min.
  6. Posteriormente se toman aproximadamente 750 µl del sobrenadante, evitando tomar o tocar la interfase que contiene proteínas.
  7. Al sobrenadante se le agregan 750 µl de Isopropanol, se homogeniza. Es recomendable dejar reposar el tubo en posición vertical, durante unos 30 min a TA o en refrigerador, para facilitar la precipitación del ADN.
  8. Las muestras son centrifugadas a 10,000 rpm por 15 min, TA.
  9. El sobrenadante es retirado cuidadosamente, procurando no disturbar el pellet donde esta depositado el ADN.
  10. Para secar el pellet, se deja el tubo abierto a 37 C, durante media hora o se coloca en un sistema de vacío.
    Finalmente el pellet seco, se resuspende con 50 µl de TE.

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Extracción de ADN a partir de tejidos ricos en mitocondrias.

Recomendado para el análisis de RFLP, en los casos que se cuente por individuo con al menos de 3 a 5 gr. de tejido rico en mitocondrias (hígado o gónadas maduras).

) Extracción de ADN mitocondrial.
1. Con un homogeneizador de aspas se homogeneiza el tejido en dos volúmenes de TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%). Durante el homogeneizado mantenga la muestra en hielo y evite la formación de espuma (característica de un exceso de molido).
2. Subyaciendo a la muestra agregue lentamente un volumen de TEK-15% sacarosa.
3. Centrifugue (1,500 x g por 10 min.  a 4ºC) y obtenga el sobrenadante.
4. Repita el paso 2 y 3.
5. Centrifugue a 18,000 x g durante 1 hora a 4 ºC. Elimine el sobrenadante. .
6. Resuspenda el precipitado con 10 ml de TEK y repita la centrifugación por 30 minutos.
7. En caso de que el sobrenadante este turbio o con pigmentos, repita el paso 6.
8. Resuspenda el precipitado con TEK (0.9 ml por cada 5 gr. de tejido inicial).
9. Agregue Igepal al 10% (en TEK), para obtener una concentración final en la muestra de Igepal al 1%.
10. Agite suavemente por 15 minutos a temperatura ambiente.
11. Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos a 4 ºC y recoja el sobrenadante.
12. Agregue 1 volumen de fenol equilibrado (pH 8.0) y agite suavemente durante 5 minutos.
13. Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y recoja la fase acuosa. Se recomienda ser muy cuidadoso, para evitar tomar partículas de la interface.
14. Repita los pasos 12 y 13.
15. Agregue un volumen de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (v:v:v 25:24:1) y agite suavemente unos segundos.
16. Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos. Recoja el sobrenadante.
17. Agregue un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (v:v 24:1) y agite suavemente unos segundos.
18. Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y recoja el sobrenadante.
19. Agregue un octavo del volumen de acetato de sodio 3 M (pH 4.8).
20 Agregue dos volúmenes de alcohol etílico absoluto a -20ºC.
21. Guardar la muestra en congelador (-20ºC) y esperar una noche.
22. Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y tire con cuidado el sobrenadante.
23. Agregue dos volúmenes de alcohol etílico al 70% a -20ºC (volumen equivalente al del paso 20).
24. Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y tire con cuidado el sobrenadante.
25. Seque el precipitado a 37ºC.
26. Resuspenda en 200 l (por cada 5 gr. de tejido inicial) de amortiguador TE- RNasa (solución 10x = Acetato de sodio 1M pH 4.8; EDTA 0.05M pH 4.8; RNasa A 0.1 gr. por cada 10 ml; se almacena a -20ºC).

Consérvese en congelación (-20ºC) hasta su uso.

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Extracción de ADN con reactivos de uso comun

PROCEDIMIENTO:

1. Se prepara un amortiguador con los siguientes ingredientes:

*120 Ml de H2O destilada fría,

*1 cucharada pequeña de sal,

*1 cucharada copeteada de bicarbonato de sodio,

*4 cucharadas de detergente

2. Triturar la muestra de tejido con poca agua en la batidora (10 segundos a velocidad máxima)

3. Mezclar en un recipiente limpio 1 volumen del triturado con 2 volúmenes del amortiguador.

4. Agitar vigorosamente durante 2 minutos.

5. En un recipiente se coloca un embudo con una gasa y se cuela la mezcla obtenida anteriormente.

6. Se toman 5 mL del colado y se vierten a un tubo de ensayo. 7

. Se añaden 2 volúmenes de alcohol de caña frío, procurando vertirlo lentamente por la pared del tubo sin perturbar la mezcla.

** Se puede observar en el producto cómo el ADN se separa y forma hebras blancas**

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Extracción Salina

descrito por Aljanabi y Martínez (1997) e

1- De 30 a 200 mg de tejido se homogeniza en 400 μl del amortiguador STE (0.4 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0), 40 μl de SDS 20% (concentración final 2%) y 8 μl de Proteinasa K (20mg/ml)

2- Las muestras se incuban a 55 °C durante 1.5 h a toda la noche; se mantienen los tubos cerrados hasta que alcanzaran la temperatura ambiente para evitar contaminación cruzada por escape de aereosoles entre muestras.

3- Se añaden 300 μl de NaCl 6M (NaCl saturado en H2O) y mezclan por 30 s a 1200 r.p.m.

4- Centrifugar por 30 min a 10,000 g.

5- El sobrenadante es transferido a un tubo nuevo, se le añade un volumen igual de cloroformo y homogeniza

6- Centrifugar por 30 min a 10,000 g,

7- La fase acuosa es transferida a un tubo nuevo y se le añade un volumen igual de isopropanol absoluto, mezclado e incubado al menos por 1 h a -20 °C.

8- Las muestras son centrifugadas a 12,000 g a 4°C por 20 min., descartado el sobrenadante y el pellet es lavado con etanol 75%

7- El precipitado es secado y resuspendido en 100 μl de TE pH 8.0 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) y almacenado a -80 °C hasta su uso.

 

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Explicación general de los protocolos

La extracción del adn, involucra la homogenización y degradación de tejidos, eliminación de compuestos orgánicos, precipitación y resuspención del ADN.

Homogenización y degradación de tejidos

Para facilitar la degradación de los tejidos, sin dañar los ácidos nucleicos, podemos combinar el uso de métodos físicos con los químicos. El más eficiente de los métodos físicos, involucra la congelación de la muestra y su posterior macerado en un mortero precongelado. La congelación más recomendable se logra con nitrógeno líquido y como método alternativo, con el uso de “hielo seco” y etanol.

Debido a las dificultades operativas de estas técnicas, es posible utilizar homogenizadores de vidrio (potter Elvehjen) y lo más común, es el macerado con una navaja sobre una superficie sólida, como podría ser un portaobjetos. Posteriormente se aplican métodos de homogenizado químico, con detergentes (para desnaturalizar los lípidos) y enzimas que facilitan la degradación de las proteínas (como proteinaza K). Con soluciones amortiguadoras se mantienen las condiciones salinas (con KCl 1 mM) y de pH neutro en la muestra (Tris-HCl, 0.25mM, pH 7.8 a 8.0). Adicionalmente se agrega EDTA (0.02 a 1.0 mM), como agente castrante de los iones magnesio y calcio, requeridos para la acción de las exonucleasas que degradan los ácidos nucleicos.

Para garantizar una adecuada reacción, los tejidos macerados, se colocan en tubos de 1.5 ml, con el amortiguador (TES, TEK o TEN), el detergente (comúnmente SDS al 0.2 % u otros detergentes no iónicos como el IGEPAL) y proteinaza K, posteriormente se tapan herméticamente y se mantienen en agitación constante, con temperaturas desde la ambiental (TA) hasta los 65 °C. Cabe aclarar que el tiempo de digestión química, varia dependiendo de la naturaleza del tejido y la técnica de conservación, ocupándose desde una hasta veinticuatro horas.

Los tiempos y cantidades de reactivos se deben estandarizar, buscando evitar la sobredigestión por efecto de las exonucleasas. Otros agentes utilizados en el homogenizado químico son la albumina (al 0.5% para remover ácidos y fosfolípidos), sorbitol o manitol (balance iónico), carbonato de sodio (controlar la concentración de sales), sacarosa (mantener la densidad del medio).

Degradación y eliminación de compuestos orgánicos

Para la degradación de los compuestos orgánicos, generalmente se utiliza fenol estabilizado, cloroformo estabilizado con alcohol isoamílico o cloroformo grado reactivo. Dependiendo de la técnica de conservación así como de las condiciones y tipo de tejido, se elige la técnica mas adecuada.

Para la eliminación de los compuestos, en cada paso se utilizan técnicas de centrifugación, con velocidades superiores a 10,000 xg con tiempos superiores a los 5 minutos.

Precipitación de los ácidos nucleicos

Después de la eliminación de los compuestos orgánicos, en solución quedan los ácidos nucleicos, debido a su alto gradiente de sedimentación en agua (o en el amortiguador). Para precipitarlos, a la solución se le incrementa notablemente la salinidad (con acetato o cloruro de sodio) y se le agrega alcohol y posteriormente es centrifugado en velocidades superiores a 10,000 xg por más de 10 minutos.

Cabe aclarar, que comunmente son utilizados dos tipos de alcohol, el etanol y el isopropanol. Con etanol, se necesita facilitar la precipitación utilizando temperaturas bajas por largos periodos (la noche a -20 °C o una hora a -70 °C). En algunos casos, pueden requerirse sucesivos lavados con alcohol, para eliminar las sales. Una vez formado el precipitado (el cual puede no observarse a simple vista), se elimina el alcohol, por centrifugación, decantación y evaporación.

El precipitado de los ácidos nucleicos, en caso de que se observe, pasara de un color blanquecino, cuando esta húmedo, a uno semi transparente, cuando está totalmente seco. Es importante eliminar totalmente el alcohol y las sales, ya que pueden interferir con las reacciones posteriores.

Resuspensión y conservación

Para la resuspensión, es prudente considerar el uso que se le dará al ADN. En el caso de requerir la muestra por unos cuantos días, para PCR (reacción de polimerasas en cadena, por sus siglas en ingles), el precipitado obtenido previamente puede resuspenderse en agua que preferentemente haya sido destilada, desionizada, nanopurificada y esterilizada (H20•ddue). Para un aplicación general se conserva en TE y en algunos casos es recomendable agregarle enzimas que degraden el ARN, como la ARNasa.

La posterior conservación se realiza a bajas temperaturas, como la de -20 °C cuando se utilizara en las siguientes semanas, o a -80 °C para mantenerla por meses o incluso años. Los protocolos específicos para la extracción del ADN dependerán de las muestras y costos de extracción permisibles (en tiempo y esfuerzo), que van desde unos cuantos pesos hasta decenas de pesos. En el primer caso, con costos muy bajos, encontramos las técnicas de extracción fenólica o de cloroformo que requieren al menos unas 4 horas de dedicación. En el mercado existen juegos comerciales, con un costo de alrededor de 3 a 6 veces el equivalente al de una extracción convencional, pero que requieren generalmente una hora de trabajo en laboratorio y generalmente con una mayor garantía de reproducibilidad.

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